Genoma da Cannabis sativa

Genoma da Cannabis sativa“por Augusto Grower e Fernando Santiago

Desavanço fitotécnico da Cannabis sativa 

A Cannabis sativa é uma cultura com grande importância antropológica, sendo umas das plantas mais antigas cultivada pelo homem, com intensa versatilidade no uso, como: adulto/recreativo (psicotrópico), medicinal (tratamento de doenças humanas e de pet´s), culinária, cordas navais, papel, concreto vegetal, entre outras.

Porém, com a proibição da planta na “Convenção Única sobre Intorpecentes” (1961), além da restrição de liberdade pessoal e social de uso, iniciou também um atraso no entendimento fitotécnico da C. sativa, em contraste com outras culturas, como tabaco (Nicotiana tabacum), soja (Glycine max), milho (Zea mays) e algodão (Gossypium hirsutum), as quais estavam avançando tecnicamente e em quantidade de área plantada. 

Infelizmente, esse cenário ainda perdura na maioria dos países, onde os pesquisadores, cultivadores e entusiastas se organizam e realizam os cultivos e pesquisas de forma receosa. Porém, em poucos casos, dependendo do local, já está havendo a legalização e abertura do mercado agrícola da cultura, onde existe intenso potencial e recurso para compensar o “tempo perdido” e acelerar o entendimento de fatores mais técnicos e aprofundados da C. sativa, onde uma dessas subáreas é a Genômica (Figura 1).

Genoma da Cannabis sativa
Figura 1. A Cannabis sativa, como qualquer outra planta, apresenta uma intensa quantidade de genes, que determinam todos os fenótipos presentes na planta. Conhecer essas sequências é de suma importância para conhecer e trabalhar com características desejáveis. Obs.: planta de Cannabis sativa feminina fecundada/polinizada (cruzamento regular ♀♂) e apresentando enchimento de sementes. Strain: Blueberry – 80% Indica (DJ Short®) Créditos de imagem: Augusto Grower & Fernando Santiago, 2022.

Genômica

A genômica (sequência completa de DNA) é a área que realiza o estudo do genoma de qualquer organismo, desde microrganismos a plantas. O Genoma é o material genético dos seres vivos transmitido à sua descendência. Na genômica, o grande objetivo é conhecer minunciosamente a sequência de genes e como ela está disposta nos cromossomos.

Posteriormente, é possível compreender molecularmente com o auxílio da transcriptômica (transcrição em RNA – expressão dos genes) a manifestação dos caracteres/fenótipos da planta, principalmente os que estão relacionados ao rendimento produtivo da planta.  

Atualmente, a genômica tem sido crucial para entender as características e especificidades de cada espécie a até mesmo diferenciar geneticamente as linhagens dentro de cada espécie ou sub-espécie. Conhecendo a sequência de genes de um organismo, é possível realizar um mapeamento genético, para conhecer onde cada gene está expressando determinado fenótipo (exemplos: altura e arquitetura de planta; expressão e concentração de cannabinóides THC, CBD, CBN, CBG; perfil de fitocromo; exigência fotoperiódica para floração; tempo de ciclo; resistência a patógenos e insetos; planta automática ou fotoperíodo, entre outros).

Porém, como a cultura C. sativa está começando a desapontar agora, a genômica e transcriptômica ainda está em momentos principiantes, onde há intensa demanda de trabalhos integrados de pesquisadores e instituições agronômicas e de melhoramento. 

Montagem do genoma da Cannabis sativa

A montagem dos genomas de plantas sempre é um desafio (mesmo com sequenciadores de leitura longa), onde a Cannabis sativa não é uma exceção. O genoma da cannabis é intensamente heterozigoto (mais de um alelo para cada característica/fenótipo), onde a frequência é de 12,5 a 40,5% de caracteres marcados por heterozigose.

Outro determinante importante é que a planta contém grandes quantidades de sequências repetidas (faixa de 70%), gerando certa complexação no estudo. Para entendimento do genoma da cannabis, já foram realizados diversos levantamentos e estudos, como o sequenciamento de 12 strains diferentes (Tabelas 1 e 2; Figura 1).

Tabela 1. Montagens de genoma, referentes a 12 Strains distintas. Adaptado e traduzido: Augusto G., 2022.

*Predominância de sub-espécies e perfil fitoquímico principal (THC; CBD): 

cs10/CBDRxa: desconhecido

Purple kush: 70% Indica/30% Sativa (THC: 22,9%; CBD: 0,5%); 

Finola (hemp): predominância Ruderalis (THC: 0,2%; CBD: 2 – 6%);

Pineapple Banana Bubba: predominância Sativa (THC e CBD: desconhecidos)

L.A Confidential: predominância Indica (THC: 20%; CBD: 1%). *Obs.: Strain campeã da “High Times Cannabis Cup 2006” (modalidade geral) e “High Times Cannabis Cup 2008” (modalidade “Indicas”); 

Chemdog 91: 50% Sativa/50% Indica (THC: 24%; CBD: 0,2%); 

Cannatonic: híbrida desconhecida (THC: 4%; CBD: 9%). Obs.: strain bastante utilizada como base genética para criação de cultivares de Hemp;  

Jamaican Lion: 50% Sativa/50% Indica (THC: 18%; CBD: 18%); 

JL: desconhecido (linhagem selvagem). 

Genoma da Cannabis sativa
Figura 1. Análise de 11 linhagens de C. sativa, evidenciando a porcentagem de genes ortólogos (genes semelhantes entre as diferentes linhagens, podendo comprovar ancestralidade em comum – genéticas com bases parecidas). Créditos de imagem: Hurgobin B, 2020.

É possível observar certos agrupamentos na similaridade de genes ortológos: 

  • CBDRx (cs10) é semelhante com Finola (hemp/cânhamo), podendo estar associado a baixa presença de THC e alta de CBD; 
  • CBDRx (cs10) é a strain com maior amplitude de genoma sequenciado; 
  • CBDRx (cs10) é semelhante com a strain JL; 
  • Jamaican Lion (geração F1) é semelhante com seu genitor Jamaican Lion Father, evidenciando a herança de caracteres;
  • A strain Pineapple Banana Bubba Kush é a linhagem mais distante;
  • De forma geral, as strains Cannatonic, Pineapple Banana Bubba Kush e Purple Kush possuem menor quantidade de genes ortólogos em relação as outras linhagens, evidenciando uma árvore genealógica bastante distinta e consequentemente com caracteres bem diferentes (exemplo: Purple Kush possui intenso teor do pigmento antocianina nas inflorescências/buds). *Obs.: existem inúmeras variações de “Purple Strains”, onde algumas possuem perfil elevado de antocianina nas flores, outras nas brácteas/fan-leaves (folhas adjacentes às inflorescências) e também podem ocorrer strains com as flores e brácteas arroxeadas concomitante.      
Genoma da Cannabis sativa
Tabela 2. Números dos cromossomos e nomes das sequências. É possível observar que muitas sequências não conferem com o número de outras linhagens, demonstrando possíveis divergências no mapeamento genético. Adaptado e traduzido: Augusto Grower, 2022.

*Crom.: número do cromossomo sequenciado

Sequência: nome da sequência inserida no banco de dados genômicos GenBank®

Evolução na montagem do genoma da Cannabis sativa

A evolução na montagem do genoma da C. sativa, como de outras plantas, passou por consideráveis mudanças, onde houveram avanços nas técnicas moleculares, de forma geral.  No início dos mapeamentos de plantas, eram bastante utilizados os sequenciadores de leitura curta (fragmentos pequenos, necessitando de diversas rodadas para completar o sequenciamento do genoma inteiro).

Posteriormente, mais frequentemente foram sendo utilizados sequenciadores de terceira geração, como exemplos: Single-Molecule Real-Time (SMRT), PacBio e MinION (Oxford Nanopore Technologies), onde foi possível aprimorar consideravelmente a similaridade genética de 12 strains sequenciadas (Tabela 1).

O estudo com os sequenciadores resultou em uma análise dos cromossomos das strains Purple Kush, Finola (cânhamo), JL (acesso selvagem) e CBDRx (cs10). Dentre essas linhagens, o genoma da CBDRx (cs10) é a montagem mais completa em questão de genes alcançados, compreendendo 25.302 genes relacionados com expressão de proteínas.

O trabalho com a CBDRx (cs10) foi tão relevante, que o “International Cannabis Genomics Research Consortium” – ICRGC (“Consórcio Internacional de Pesquisa em Genômica de Cannabis”) realizou a proposta de coloca-lo como o modelo genômico da Cannabis sativa, onde o genoma completo está distribuído ao longo de 10 cromossomos. 

Genes sexuais na C. sativa

O mapeamento dos cromossomos sexuais da Cannabis sativa foi outro avanço possível devido à genômica. Foram correlacionados 3500 genes com a determinação do sexo, onde a transcrição desses genes foram observados no genoma da Purple Kush e CBDRx (cs10 v 1.0 e cs10 v.2.0). Os genes estavam localizados nos cromossomos 1 e 10 (par de cromossomos sexuais).

Essas informações permitiram fazer uma varredura nesses loci dos cromossomos, onde pode gerar informações para melhorar principalmente as plantas femininas, com o aumento de caracteres intimamente relacionados ao sexo, como a concentração de cannabinóides.

Alguns cannabinoides altamente ligados ao sexo, como THCA (forma ácida do tetrahidrocannabinol) e CBDA (forma ácida do cannabidiol) são produzidos em concentrações intensamente maiores nas flores de plantas fêmeas (gineceu – pistilos) em comparação com as plantas machos (androceu – anteras). Com a genômica, pode surgir a capacidade de identificar previamente o sexo das plantas (unificação do sexo), onde para a produção comercial será de extrema importância (Cultivo Sensimilla).

*É importante ressaltar que os genes sexuais não estão restritos e localizados apenas nos cromossomos sexuais (cromossomos 1 e 10),  muitos também estão localizados em outros cromossomos e relacionados também na produção de tricomas tectores e glandulares, hermafroditismo e independência de fotoperíodo (plantas automáticas – subespécie ruderalis).

Expressão de Cannabinóides 

A compreensão do genoma da C. sativa elucidou várias vias de expressão da síntese de metabólitos secundários importantes para o mercado da planta, como o a produção de THC e CBD.

Nos estudos, ficou evidente que os genes THCAS (gene responsável pela expressão da forma ácida do tetrahidrocannabinol) e CBDAS (gene responsável pela expressão da forma ácida do cannabidiol) estão em locus diferentes, porém no mesmo cromossomo, tendo certa proximidade genômica, podendo estar relacionado com uma origem em comum, mesmo sendo metabólitos distintos.  

Para analisar a expressão de cannabinóides, são feitos comparativos de primers/marcadores nas sequências (RNA-seq) de tricomas glandulares e tecido foliar proveniente de brácteas, onde ficaram evidentes, os seguintes resultados:  

  • A via de produção de THCA foi aumentada 15x em flores de Purple Kush em relação à linhagem Finola (hemp), gerando um contrase no perfil metabólico secundário. 
  • Para analisar a diferença de concentração de cannabinóides, foram realizadas várias amostragens, com várias plantas de cada linhagem e variações de tricomas glandulares (vários morfotipos);  
  • Na expressão de terpenos, ficou claro que o gene CsTPS está envolvido no acúmulo de mono e sesquiterpeno nas flores; 
  • O gene CBDAS está presente em maior número de cópias em comparativo com os genes THCAS CBCAS (expressão do cannabicromeno – cannabinoide sem efeito psicotrópico e com efeito entourage); 
  • Possivelmente os genes THCAS e CBCAS são originados do CBDAS (através de evolução, possíveis indel´s – inserções e deleções genéticas ocorrendo através da duplicação de genes ao longo de cruzamentos) (Figura 2); 
  • As sequências de nucleotídeos do gene CBDAS é altamente similar entre as 12 linhagens (mais de 99% de identidade de nucleotídeos); 
  • Os consecutivos cruzamentos realizados pelos cultivadores para adquirir plantas com alto nível de THC geraram alta presença e replicação dos genes THCAS e CBCAS em vários loci dos cromossomos (Figura 3); 

Vários genes THCAS, CBDAS e CBDAS posicionados em vários loci do cromossomo 6 não são expressos (genes inativos).

Genoma da Cannabis sativa
Figura 2. Comparativo de sequência de genes responsáveis por expressão de distintos cannabinóides: gene THCAS – GenBank acc. nº AB057805.1; gene CBDAS – GenBank acc. nº AB292682.1; gene CBCAS – GenBank acc. nº LY658671.1; *É possível observar que as sequências dos genes THCAS, CBDS e CBCS possuem bastante similaridade e identidade de nucleotídeos e aminoácidos, provavelmente definidos por fenômenos evolutivos, onde o THCAS e CBCS são originários do CBDS. Créditos de imagem: Hurgobin B, 2020.
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Figura 3. Meta-análise e árvore filogenética descrevendo o mapeamento genômico dos genes THCAS, CBDAS, CBCAS das 12 strains (tabela 1). As sequências de nucleotídeos estão mencionadas como ativas/funcionais e também inativas (THCAS e CBCAS). É possível observar que todos os genes CBCAS agrupam com o clado dos THCAS, evidenciando a alta semelhança genética e expressão conjunta desses dois cannabinóides (possivelmente estando envolvidos no efeito “entourage/sinérgico”). Créditos de imagem: Hurgobin B, 2020.
Genoma da Cannabis sativa
Figura 4. Planta modelo de Cannabis sativa (cs10 v.1.0) com o mapeamento de genes provenientes de tricomas glandulares (expressão de cannabinóides). Foram encontrados 13 loci (localização dos genes) nos cromossomos 2, 5 e 7. Créditos de imagem: Hurgobin B, 2020.

LOC115718836 (THC ativo/expresso);  

LOC115720716 (THCA ativo/expresso); 

LOC115717841 (CBDA ativo/expresso);  

LOC115697880 (THCA inativo); 

LOC115696609 (THCA inativo); 

LOC115698060 (THCA inativo); 

LOC115697886 (THCA inativo); 

LOC115696884 (CBDA ativo/expresso); 

LOC115697762 (CBDA ativo/expresso); 

LOC115696987 (CBDA ativo/expresso); 

LOC115696986 (THCA ativo/expresso);  

LOC115697126 (CBDA ativo/expresso); 

LOC115697019 (CBDA ativo/expresso); 

Expressão de Terpenos

A planta da cannabis é uma grande produtora de terpenos (predominância de mono e sesquiterpenos) no seu perfil fitoquímico, onde a associação desses metabólitos secundários com os cannabinóides tem um poder de efeito “entourage/sinergia”.

A análise genômica rastreou 55 genes CsTPS envolvidos com a expressão de terpenos na C. sativa. Os genes foram divididos em subfamílias: CsTPS-a (síntese de sesquiterpeno) e CsTPS-b (síntese de monoterpeno), evidenciando uma grande divisão e variedade de terpenos já relatados, como: myrcene; pinene; linalool; limonene; humulene; eucalyptol; valencene; trans-nerolidol; terpinolene; phytol; geraniol; delta-3-carene; caryophylenne; camphene; borneol; bisabol, dentre outros. A divisão em sub-famílias de genes relacionados a expressão de terpenos revela que houveram duas grandes pressões/seleções direcionais para a diferenciação em monoterpeno  (arranjo molecular com 2 isopropenos) e sesquiterpeno (arranjo molecular com 3 isopropenos). 

Genômica na diversidade e criação de “Plantas Elite”

Os estudos em genômica e transcriptômica da C. sativa podem auxiliar os cultivadores e breeders/melhoristas a criarem perfis de cultivares “elite” de acordo com o perfil de mercado. Dessa forma, é possível identificar e manusear vários fatores desejáveis, como exemplos: 

  • Distinção e criação de cultivares com ótimo rendimento e destinação para uso adulto, medicinal e hemp; 
  • Síntese acentuada de cannabinóides; 
  • Montagem personalizada de perfil de terpenos;
  • Rastreabilidade das linhagens ancestrais; 
  • Padronização e classificação real das Strains, onde atualmente com o lançamento de muitas cultivares parecidas, há muita perda de características marcantes e únicas de cada linhagem; 
  • Com a qualidade na criação das cultivares, o próprio breeder pode gerar uma tendência ou educação de mercado consumidor, sempre visando à evolução qualitativa das strains; 
  • Aumento do vigor das strains híbridas (cruzamentos com mais de uma sub-espécie: sativa, indica, ruderalis). 

Pangenômica da Cannabis sativa

Uma das limitações do baseamento em um genoma isolado (exmplo: cs10 v 1.0) é a pobreza em detalhes genéticos e caracteres expressos, pois é apenas uma cultivar dentre inúmeras. Nesse sentido, o pangenoma é uma alternativa extremamente valiosa, onde pode ser considerado com um meta-genoma reunido, incluindo genomas completos de várias linhagens dentro de uma mesma espécie, onde o principal objetivo é reunir as informações genéticas de várias strains (aumento de diversidade), expandindo a quantidade de informações e podendo trabalhar com um conjunto de caracteres, podendo ter mais “poder” para montar uma “Strains de Elite”, com alta carga produtiva. 

O cenário de pangenoma para a Cannabis sativa não está distante, pois com o aumento da acessibilidade de sequenciadores de leitura longa, a rapidez na construção de genomas completos de várias strains é um fator acelerador. Em outras culturas, o futuro já é uma realidade, como exemplo, o primeiro pangenoma de soja (Glycine max), foi construído em 2020, utilizando 29 linhagens silvestres, landraces e comerciais (Figuras 5 e 6).

Genoma da Cannabis sativa
Figura 5. Linhagens comerciais, landraces e linhagens silvestres de soja (Glycine max) provenientes de todos os continentes, utilizadas na construção do primeiro pangenoma da cultura, intensificando o conhecimento genético da cultura, que futuramente pode ser utilizado no melhoramento genético. Créditos de imagem: Liu Y, 2020.
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Figura 6. (A) Pangenoma construído da soja, com a presença dos genomas completos das 29 linhagens distintas; (C) Todos os acessos utilizados na construção. Créditos de imagem: Liu Y, 2020.

Considerações Finais

A riqueza genética da Cannabis sativa ainda está longe de ser amplamente compreendida, onde estamos em passos iniciais. Porém com o avanço e rapidez das técnicas moleculares, em um futuro breve teremos um arsenal de informações para a escolha de caracteres desejáveis, principalmente de acordo com as demandas do mercado consumidor.

Nesse sentido, todo o conhecimento que for adquirido com a genômica será extremamente útil para aprofundar sucessivamente na criação de plantas “Elite”, onde o alcance em patamares de rendimento e fitoquímicos (ex: concentração de cannabinóides) ainda são inimagináveis. 

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